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 Notes de cours

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Nicolas
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MessageSujet: Notes de cours   Sam 18 Mar à 13:26

1. Organisation du génome
1. 1. Généralités
Le génome humain compte 46 chromosomes: 23 sont d'origine paternelle, et 23 d'origine maternelle. Au sein de ce patrimoine génétique, on peut distinguer deux types de génome:
- génome nucléaire: origine moitié paternelle et moitié maternelle; le génome haploïde contient 3x10p9 paires de bases, codant pour 25'000 à 30'000 gènes, et permettant hypothétiquement de former un million de protéines.
- génome mitochondrial: origine maternelle; compte 16'000 paires de bases, codant pour 37 gènes.

Le génome masculin compte plus de gènes différents que le génome féminin; ce dernier compte cependant plus de gènes. En effet, le génome masculin compte deux chromosomes partiellement différents, X et Y, et Y contient des gènes qui ne sont pas présents sur X; cependant, le chromosome X contient plus de gènes que le chromosome Y, ceci dû à sa plus grande taille.

La valeur C (contenu) est paradoxale; elle montre qu'il y a beaucoup plus de paires de bases que ce qui est nécessaire. Les gènes sont interrompus, et les régions intergéniques sont importantes. On peut différencier trois types de séquences sur la molécule:
- hautement répétées
- intermédiaires
- uniques.

La taille d'un gène varie énormément; on peut cependant dire qu'elle est en moyenne de 10 à 15 kilobases [kb].
La distance intergénique moyenne dans le génome nucléaire est de 25 à 30 kb.

Rappel: l'exon est la partie du gène codant pour une protéine, l'intron est la séquence clivée au cours du mécanisme d'épissage.

Le nombre d'exons et leur taille est normalement proportionnel à la taille du gène, comme le nombre d'introns. La taille moyenne des séquences codantes d'un gène est de 1.5 kb, ce qui représente 50 codons. La présence d'introns et de mécanismes d'épissage alternatif permettent de former plus de protéines qu'il y a de gènes. Actuellement, les recherches permettent d'authentifier la présence d'environ 100'000 protéines; on suppose qu'il y en a encore plus.

1. 2. Classification des gènes
Il existe ce que l'on appelle des "familles de gènes". Les gènes qui la composent, dérivent tous d'un exon ancestral, qui a subi diverses modifications (conversion génique; duplication, fusion etc.). Ils ont tous des fonctions identiques ou proches. On peut les rencontrer sur le même chromosome ou sur deux chromosomes différents. Les familles multigéniques peuvent être de trois types:
- Type I: haut degré d’homologie entre les différents membres de la famille.
Ex: histones, rRNA, protéines ribosomiques
- Type II: Haut degré d’homologie dans certaines régions seulement.
Ex: Domaine homeobox (60 acides aminés présents sur les facteurs morphogénétiques), Death domain (interagissent pour conditionner la mort cellulaire).
- Type III: Homologie uniquement pour des motifs en acides aminés très courts.
Ex: DEAD box = Asp-Glu-Ala-Asp présent dans les RNA hélicases.

Un "gene cluster" est un regroupement, dans la même région chromosomique, de gènes identiques (globines) ou très proches. Les globines sont issues de la duplication initiale d'un gène, qui a ensuite évolué par perte, fusion, duplication, inactivation en pseudogènes ou conversion génique, ce qui a permis l'évolution de cette famille de protéines. Par exemple, au cours de l'évolution telle qu'on se la représente, delta a été convertie par bêta; ceci fait que le gène delta comprend dès lors des séquences spécifiques à bêta.
Une "superfamille de gènes" est un ensemble de gènes possédant une organisation générale commune (exon ancestral) mais pas la même fonction. C'est le cas de la superfamille des immunoglobulines.

1. 3. Classification des séquences intergéniques
Il existe différents types de séquences répétées:
• Séquences répétées en tandem:
- satellites: ADN principalement centromérique, mais parfois hétérochromatique, constitué de blocs de 100 kb à plusieurs Mb de longueur. L'ADN satellite a une densité différente du reste du ADN; ceci fait qu'au cours des premières recherches, qui consistaient à centrifuger de l'ADN, on l'ait qualifié de "satellite", car il avait une densité bien différente de celle du reste de l'ADN.
- minisatellites: blocs de 0.1 à 20 kb correspondant à des répétitions de 6 nucléotides (TTAGGG) dans les régions télomériques, ou de 9 à 24 nucléotides, présents sur tous les chromosomes, aussi appelés VNTR, de constitution très polymorphique. Les minisatellites servent de sites préférentiels de recombinaisons.
- microsatellites: blocs de moins de 150 pub correspondant à des répétitions de 1 à 4 nucléotides, présents sur tous les chromosomes. Ils occupent 0.3% du génome, et y sont plus dispersées que les minisatellites.
• Séquences répétées dispersées:
- SINE (Short Interspersed Nuclear Elements): classe composée de séquences comme AluI, qui compte 280 pb et un site de restriction. AluI est présente entre 700'000 et un million de fois dans notre génome; cette séquence est spécifique au génome des primates. On ne la rencontre donc pas chez la souris. On imagine qu'elle se propage par retrotransposition, en parasitant la rétrotranscriptase des LINEs.
- LINE (Long Interspersed Nuclear Elements): de taille supérieure à mille bases, comprend une famille de séquences autonomes, capables de se dupliquer par elles-mêmes, en codant pour des transcriptases inverses. Leur mécanisme est très proche des rétrovirus, comme HIV.

Exemples:
• Le satellite alpha (riche en A et T; on parle aussi de séquence alphoïde) est constitué d'une répétition de 171 pb. On le rencontre dans les centromères de tous les chromosomes. Il représente 3 à 5 % de l'ADN de chaque chromosome.
• Certaines maladies sont causées par la répétition de triplets:
- la chorée de Huntington est causée par l'augmentation de CAG, qui passe de 11 à 34 chez un individu sain à 40 à 200 chez un individu atteint.
- l'ataxie de Friedreich est causée par l'augmentation de GAA, qui passe de 7 à 38 chez un individu sain à 66 à 1700 chez un individu atteint.
- le syndrome "X fragile" est causé par l'augmentation de CGG, qui passe de 6 à 50 chez un individu sain à 200 à 1300 chez un individu atteint.
- la dystrophie myotonique est causée par l'augmentation de CTG, qui passe de 5 à 35 chez un individu sain à 50 à 2000 chez un individu atteint.
- l'ataxie spinocérébellaire est causée par l'augmentation de CAG, qui passe de 10 à 30 chez un individu sain à 44 à 81 chez un individu atteint.
• LINE 1 , aussi appelée "famille Kpn", a une longueur de 6.1 kb, et une autre forme de 1.4kb. On la rencontre 60'000 à 100'000 fois dans notre génome, ce qui représente une copie tous les 50kb.

1. 4. Analogies et différences entre le chimpanzé et l'humain
La similitude entre deux ADN d'individus appartenant à l'espèce Homo sapiens est de 99.9 %. La différence est donc d'environ un nucléotide toutes les 1000 paires de bases. Elle est de 99.0 % entre Homo sapiens et Pan troglodytes (chimpanzé):
- La taille du génome est identique: elle compte environ 3 x 10p9 pb pour les deux génomes haploïdes, et l'estimation du nombre de gènes est la même.
- La constitution des chromosomes est aussi très similaire.
- La conservation de la synténie (organisation commune) est étendue.
- L'organisation des familles de gènes est extrêmement similaire.
- Les séquences codant pour de l'ADN sont similaires de 98 à 100 %.
- Les séquences non-codantes sont similaires à 98 %; certaines séquences ne se rencontrent cependant que chez l'humain.
- L'expression des gènes est en général très similaire.
- Les séquences non-codantes répétées en tandem sont hautement conservées.
- La séquence Alu se rencontre aussi bien chez les grands singes que chez l'humain.

Les modifications du génome n'ont donc que peu d'importance quantitativement; on observe cependant que la sensibilité à certains facteurs est différente:
- VIH est une maladie commune chez h'humain et rare chez le chimpanzé
- l'influenza A (grippe) développe des symptomes plus sévères chez l'humain que chez les singes
- l'hepatite B/C entraîne des complications plus sévères chez l'humain que chez les chimpanzés
- le Plasmodium falciparum (malaria) touche l'humain, mais pas le singe
- la ménopause est universelle chez l'humain et rare chez le singe
- l'humain est résistant à E. Coli K99 (gastroentérite), alors que le singe est susceptible de la développer
- les différentes expressions d'Alzheimer est complète chez l'humain et incomplète chez le singe
- les cancers épitheliaux sont communs chez les humains et rares chez les singes.

Les différences principales sont dues à:
- FOXP2: facteur de transcription; deux acides aminés sont modifiés entre le génome humain et simiesque. On estime que cette différence est à l'origine du langage.
- Lactase: l'homme possède un gène permettant une métabolisation du lactase, ceci dû au régime lacté qu'il a adopté au fil de son évolution.
- Système immunitaire: les gènes du système immunitaire humain sont moins nombreux; par exemple, la caspase 12 est chez nous un pseudogène. tandis qu'elle est un gène conventionnel chez le chimpanzé. La caspase 12 provoque une réaction plus violente en cas d'agression, conduisant facilement à une septicémie (infection généralisée); l'inactivation de la caspase permet donc une résistance à la septicémie.
- Mastication: des myoglobines impliquées dans le mécanisme de mastication sont inactivées chez l'humain; ceci a sans doute permis le développement du cerveau.
- Odorat: l'odorat des chimpanzés est plus développé que celui des humains.
Ceci montre que la pseudogénisation peut parfois constituer un avantage évolutif.

1. 5. Analogies et différences entre la souris et l'humain
Les différences sont plus prononcées qu'entre l'humain et le chimpanzé:
- La taille du génome et le nombre de protéines qu'il peut synthétiser est similaire.
- L'humain compte 22 autosomes et deux chromosomes sexuels, X et Y. La plupart des chromosomes sont méta- ou submétacentriques. La souris compte 19 autosomes et deux chromosomes sexuels, X et Y. Tous sont acrocentriques.
- Le génome humain compte environ 45'000 îlots CpG; la souris n'en a pas.
- La conversion de la synténie est faible, si l'on excepte le chromosome X. Les régions concernées sont petites.
- Dans le chromosome X, la synténie est très proche; les seules modifications sont dues à quelques inversions entre gènes.
- L'organisation des familles est similaire, tant qu'il s'agit de familles individuelles. Les quelques différences sont causées par des duplications récentes évolutivement.
- L'organisation des gènes est généralement commune; la taille des gènes et la position des introns est bien conservée.
- Les séquences codantes sont homologues de 70 à 90 %, et le polypeptide produit est normalement homologue à un degré de 75 à 95 %.
- Les séquences non-codantes sont généralement extrêmement dissemblables.
- L'expression des gènes est en général très similaire.
- Les séquences répétées en tandem sont bien conservées au niveau des télomères; sur le reste du génome, leur séquence n'est normalement pas conservée.
- Certaines séquences dispersées sont conservées, comme l'élément LINE-1. La séquence Alu de l'humain et B1 de la souris ont sans doute la même origine.
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Nicolas
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MessageSujet: Re: Notes de cours   Sam 18 Mar à 13:26

2. Maintien de l'information génétique
2. 1. Généralités
La réplication est semi-conservative et bidirectionnelle. Elle nécessite une ADN-polymérase, qui doit fonctionner sur une matrice et qui nécessite une amorce présentant une terminaison 3'-OH.

2. 2. Variations dans le génome
Les variations sont dues à des modifications de bases (ce qui est absolument normal), à des mutations (ce qui est moins normal) et au système de réparation.
Les bases modifiées les plus fréquentes sont:
- la 5-méthyl-cytosine (dans les cellules humaines)
- la 6-méthyl-adénine (chez les bactéries)
- la pseudo-uridine

Les îlots CpG sont sous-représentés par rapport aux autres îlots présents dans le génome humain. Ceci est dû au fait que, la 5-méthyl-cytosine est déaminée en thymidine, qui est indifférenciable d'une base normale. En outre, les îlots CpG jouent un rôle particulier dans la régulation, ceci dû au fait qu'ils sont hypométhylés par rapport aux autres séquences, pour empêcher leur conversion.

On distingue les mutations selon la taille des séquences touchées (mutations ponctuelles ou segments larges), et la localisation de ces séquences (somatique ou germinale). Si la mutation touche les cellules germinales, elle se transmet à la descendance. La conséquence des mutations peut être néfaste, neutre ou bénéfique. Les mutations peuvent avoir lieu:
- pendant la réplication: substitution (transitions ou transversions), délétion, insertion ("DNA slippage")
- pendant la recombinaison réciproque (crossing over)
- lors de recombinaisons non-réciproques (conversions géniques)
- à cause d'une amplification, souvent due à des oncogènes
- suite à des transpositions ou rétrotranspositions (LINE ou SINE)
- suite à l'effet d'agents chimique sou physiques.

La transition est la conversion entre deux bases de même type (purine -> purine; pyrimidine -> pyrimidine), la transversion entre deux bases de type différent (purine -> pyrimidine; pyrimidine -> purine).

L'origine des mutations est surtout due aux erreurs spontanées lors de la duplication; les agents mutagènes ne provoquent qu'une petite partie des mutations. Pendant la vie, qui comprend 10p16 à 10p17 mitoses, chaque gène peut être le site de 10p8 à 10p10 mutations.
Les mutations sont principalement dues à la forme tautomérique des nucléotides.
La fixation des mutations se fait uniquement quand le brin muté est utilisé comme matrice du brin complémentaire. Elle n'est que provisoire tant que la phase S n'a pas eu lieu.
L'activité de correction d'erreurs ("proof reading") limite grandement la survenue des fautes que peut commettre l'ADN polymérase. C'est l'activité exonucléase 3'-> 5' qui enlève les nucléotides inadaptés. le taux d'erreurs est de 1/10p6 à 1/10p10 pb par réplication.

Lors de la réplication de l'ADN, les brins peuvent glisser l'un sur l'autre; on parle de "slippage". Ceci peut induire une addition ou une délétion. Les régions privilégiées pour ce genre de fautes sont les séquences répétées. Ainsi, un trop grand nombre de codons répétés peut induire le syndrome "X fragile", par exemple (cf. supra). Dans les séquences répétées, le slippage est presque aussi stable que la configuration de base, puisque tout l'appariement peut se faire sur de grandes séquences.
La conversion génique est un échange non réciproque: un gène donne son information à un autre gène, mais est conservé dans son intégralité. Ceci peut se rencontrer intralocus (dans le même locus) ou interlocus. Un grand degré d'homologie est nécessaire: lors de la réplication, le brin d'ADN exogène doit être fixé sur une séquence complémentaire.

Les agents chimiques et physiques peuvent aussi modifier le génome:
- l'agent physique le plus mutagène est le rayonnement ultraviolet, produit par le soleil. Une heure d'exposition au soleil induit la formation de 80'000 dimères de thymine par cellule exposée.
- les agents chimiques les plus fréquemment rencontrés sont des gaz: l'oxygène forme facilement des ions superoxades; le gaz moutarde ou le gaz nitreux ont un effet très fort sur la survenue de mutations.
Les deux réactions chimiques qui entraînent le plus de mutations sont:
- la dépurination: coupure d'une liaison bêta-N-glycosidique par un proton, ce qui détache la base de son squelette de phosphate et de ribose. Dans une cellule humaine, 500 purines sont perdues par jour. La dépurination est principalement causée par les agents chimiques.
- la déamination: conversion d'une cytosine en uracile et d'une 5-méthyl-cytosine en thymine. Environ 100 bases sont déaminées par jour. La cause principale est la présence d'agents chimiques.
Certains agents chimiques, comme l'EMS, l'acide nitreux ou l'hydroxylamine, modifient des bases par déamination. L'acridine provoque des délétions ou des insertions.
Des analogues des bases peuvent aussi être intégrées, comme le 5-bromouracile ou la 2-amino-purine, qui forment des dimères céto-énol.
Les sites dépurinées, appelés sites ap (apuriniques) fixent une base au hasard lors de la réplication.
Les formes d'oxygène actif provoquent l'oxydation, ce qui peut transformer des bases: la thymindine peut être mutée en thymidine-glycol, qui bloque la réplication; la 8-oxo-7-deoxyguanosine cause des transitions entre G et C et entre A et T. Ceci peut causer l'apoptose, mais aussi des cycles cellulaires anormaux et des mutations.
L'acridine orange ou la proflavine s'intercalent à l'intérieur de l'ADN. Elles sont parfois utilisées, tout comme l'actinomycine-D, pour bloquer la réplication et causer l'apoptose. Leur utilisation principale est un traitement contre le cancer.
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Nicolas
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MessageSujet: Re: Notes de cours   Ven 24 Mar à 21:01

Il existe différents mécanismes de réparation. Ils permettent d'éviter la survenue de cancers et de mutations. Leurs principes sont bien conservés au cours de l'évolution, de même que le degré d'homologie des protéines qui les compose. On les rencontre chez tous les organismes, à l'exception des virus. Ils peuvent être actifs pendant la réplication (mécanisme de "proof reading" de l'ADN polymérase, mais aussi à d'autres moments: la réparation des "mismatch" (mauvais appariement) faites par l'ADN polymérase sur le nouveau brin synthétisé survient après la fin de la réplication, et la réparation des bases altérées peut intervenir à tout moment: les protéines concernées sont efficaces sans ADN polymérases. Les mécanismes peuvent être spécifiques et fonctionner en une étape:
- les photolyases réparent les dommages causés par la lumière (UV): ils coupent les dimères de thymine, et parfois les dimères de cytosine, qui sont cependant plus rares. On les rencontre chez E. coli et chez la levure. Le mécanisme impliqué est la photoréactivation: en cas d'exposition à la lumière, les protéines PHRa et PHRb sont exprimées. Elles utilisent la lumière visible pour séparer les dimères de thymine.
ou non spécifiques, et inclure plusieurs étapes:
- BER (Base Excision Repair) fonctionne dans le cas des déaminations et des dépurinations. Dans le cas des déaminations (cytosine), le mécanisme fonctionne en quatre étapes:
1) une glycosylase coupe la base non spécifique
2) une endonucléase "AP" coupe le lien sucre-phosphate
3) une ADN polymérase incorpore la base correcte. Dans certains cas, il peut s'agir de plusieurs bases, avec un maximum de six
4) une ADN ligase fixe la liaison sucre-phosphate
La glycosylase est une protéine très spécifique; il en existe plusieurs types. Quand une uracile est présente dans la molécule, la glycosylase impliquée est une uracile-ADN-glycosylase; on rencontre le même type de protéines pour les xanthines, hypoxanthines, etc.
Dans le cas des dépurinations, l'étape 1 n'a pas lieu; le mécanisme BER commence à l'étape 2.
- NER (Nucleotide Excision Repair) est utilisé dans les cas de dimères de thymidine et de mismatch. Les étapes sont:
1) une excision-endonuclease coupe le brin lésé à dix à trente bases en amont et en aval
2) une hélicase retire la région lésée
3) une ADN polymérase synthétise la région manquante
4) une ADN ligase fixe la liaison sucre-phosphate
Chez E. coli, un mécanisme de méthylation est impliqué: des séquences palindromiques (GATC) sont méthylées sur l'adénine par la protéine dam (DeoxyAdenineMethylase). Quand la réplication survient, seul le brin matrice est donc méthylé. En cas de mismatch, la protéine MutS (Mut est l'abréviation de mutator: quand ce facteur est muté, toute la cellule ne peut plus réparer ses erreurs et accumule les mutations) vient se fixer sur la séquence mutée. La protéine MutL stabilise le complexe; MutL, une exonucléase, dégrade l'ADN du lieu où se trouve le mismatch jusqu'à la séquence palindromique; l'ADN polymérase la synthétise ensuite à nouveau. Le mécanisme est le même chez les eucaryotes, bien que les protéines ne portent pas les mêmes noms. Il a été étudié grâce à la maladie Xeroderma pigmentosum.
- la réparation par recombinaison peut être utilisée dans le cas de lésions T-T comme de délétions; le brin lésé n'a pas de matrice; il utilise donc la matrice d'un gène homologue, par exemple situé sur le chromosome homologue, pour synthétiser la région manquante.

Il existe différentes maladies dues à des défauts génétiques impliquant des protéines impliquées dans le mécanisme de réparation:
- Xeroderma pigmentosum est une maladie autosomique récessive rare caractérisée par un fonctionnement altéré du mécanisme NER, qui sépare les dimères de thymine. La maladie augmente de 1000 à 4000 fois la sensibilité des sujets aux ultraviolets, et entraîne la survenue de kératose (pigmentation anormale) et de cellules tumorales.
- HNPCC (Hereditary NonPolyposis Colorectal Cancer) est un cancer non-polypeux; c'est-à-dire qu'il n'est pas lié à la présence de polypes, qui sont des facteurs prédisposant aux cancers, entraînés par la mutation des protéines FRAP et P53. Dans le cas de cette maladie, ce sont les protéines hMSH1 (l'équivalent de MutL) et hMSH2 (l'équivalent de MutS) qui sont mutées. Ces mutations empêchent la réparation des "mismatch".
- le syndrome de Bloom, la maladie de Franconi et les cancers du sein héréditaires BRCA1 et BRCA2 sont dus à l'impossibilité de réparer la rupture des double-brins par recombinaison homologue.

2. 3. Génie génétique
Biologie moléculaire: Etude des être vivants au plan moléculaire; principalement: étude du génome et des protéines formées.
Génie génétique : Ensemble des techniques de manipulation et de transfert de gènes permettant la modification du patrimoine génétique d'un organisme vivant. Aussi appelé technologie de recombinaison de l'ADN. Il peut s'agir aussi de modification de gènes. Permet l’identification, l’analyse et la mutagenèse des gènes et leur expression dans des cellules, ou organismes, homologues ou hétérologues.
Le développement de la technique de l'ADN recombinant a suivi une longue histoire, dont les faits importants sont:
1869: Miescher isole l’ADN pour la première fois.
1944: Avery apporte la preuve que l’ADN, plutôt que les protéines, porte l’information génétique au cours de la transformation bactérienne.
1953: Watson et Crick proposent un modèle en double hélice pour la structure de l’ADN basé sur des résultats obtenus par Franklin et Wilkins avec les rayons X.
1962: Arber met en évidence pour la première fois l’existence des enzymes de restriction de l’ADN; cela aboutit par la suite à leur purification et à leur utilisation dans la caractérisation des séquences d’ADN par Nathans et H. Smith.
1975: Southern développe l’hybridation après transfert du gel pour la détection de séquences d’ADN spécifiques.
1985: Mullis et ses collaborateurs inventent la réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

Les enzymes de restriction, aussi appelées nucléases de restriction, constituent un outil très important qui permit les développements majeurs du génie génétique. Ils permettent d'établir des cartes de restriction, mais aussi de faire du clonage molculaire ou du RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
Les enzymes de restriction constituent le système de défense bactérien contre les bactériophages, qui sont les virus des bactéries. Ils permettent la coupure (on parle de digestion) de l'ADN à une séquence précise et spécifique. Il s'agit donc d'endonucléases générant des fragments de taille définie.
Il existe une classification des enzymes de restriction; mentionnons simplement que l'endonucléase EcoR1 porte ce nom parce qu'elle a été découverte chez E. coli et qu'il s'agit du premier enzyme de restriction découvert chez cette bactérie. Il s'agit d'une enzyme de classe 2.
Le clivage se fait sur des séquences spécifiques, qui ont toujours la particularité d'être palindromiques. Il peut générer une terminaison franche, c'est-à-dire que les deux brins s'arrêtent côte à côte, ou des extensions appelées "sticky ends", qui font que quelques nucléotides dépassent de l'extrémité 3' ou 5'. On connaît actuellement plus d'une centaine d'enzymes de restrictions.
La carte de restriction permet de localiser les sites de clivage des enzymes de restriction le long de la molécule d'ADN. La longueur des fragments coupés est établie par électrophorèse: les molécules sont placées dans un gel d'agarose; elles migrent selon leur taille sous l'effet d'un champ électrique: plus les fragments sont petits et plus ils migrent loin. La détermination des sites de coupure se fait par recoupement logique entre plusieurs enzymes. La migration de fragments de taille connue servent souvent à étalonner le gel et à déterminer la taille des fragments inconnus. Le gel est coloré au bromure d'éthidium, ce qui permet d'observer les molécules d'ADN sous lumière ultraviolette. Cette méthode ne peut être utilisée que sur les petites séquences.
Les cartes de restriction d'une séquence permettent de déterminer le degré d'homologie des séquences entre individus d'une même espèce ou d'espèces proches.
L'hybridation de l'ADN selon Southern est appelée "Southern blot": elle permet de détecter une séquence particulière dans une collection de fragments séparés par électrophorèse. La méthode est basée sur l'appariement du brin radiomarqué connu (sonde) avec sa séquence complémentaire sur le brin étudié. Cette technique est aussi appliquée en cartographie physique sur des chromosomes intacts; on parle d'hybridation in situ. Elle se fait par dénaturation des ADN double-brins et des sondes, puis par hybridation dans un milieu favorable. Les ADN étudiés peuvent de nouveau s'apparier, mais aussi s'apparier avec des sondes. Ensuite, on effectue une électrophorèse dans de l'agarose, et on fixe l'ADN sur un film de nitrocellulose.
La technique est aussi applicable à l'ARN; dans ce cas, elle s'appelle Northern blot.
Le Southern blot permet par exemple de détecter de petites mutations ponctuelles lorsqu'elles affectent la présence ou la longueur d'un fragment de restriction. On parle de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), utilisé en génétique des populations, en diagnostic génétique, par la médecine légale ou par la police scientifique.
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David
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MessageSujet: Re: Notes de cours   Sam 25 Mar à 22:26

Un site qui explique très bien le southern blot et que je recommande pour une bonne compréhension de ce procédé.
www.ac-creteil.fr/biotechnologies/doc_southernblotting.htm

Le Southern blot
1) On traite l'ADN avec des enzymes de restriction
2) On colore l'ADN avec du bleu de bromophénol de manière à voir sa progression électrophorétique
3) On injecte cet ADN dans du gel d'agarose. Des petits puits prévus pour injecter l'ADN se trouvent dans le gel d'agarose du côté de la catode (-)
Le gel d'agarose baigne dans une solution tampon.
On injecte dans un autre "puits" de "l'ADN référence" de manière à pouvoir comparer les résultats (les migrations pouvant varier selon les gels d'agarose)
4) Le bac ou baigne le gel d'agarose est mis sous tension électrique.
5) L'ADN, qui est chargé négativement, migre vers l'anode (+) Sa progression est visible grâce au colorant bleu.
6) Lorsque le colorant le plus rapide à migrer est arrivé à l'extrémité + du gel d'agarose, on coupe le courent.
7) L'ADN est alors traité avec un agent intercalant : le bromure d'éthidium, qui permet de visualiser l'ADN sous lumière UV. On apperçoit des bandes rouges à différents niveaux de migration.
8) On traite l'ADN (qui est encore contenue dans le gel d'agarose) dans un milileu basique de manière à casser la double hélice et avoir uniquement des fragments monobrins.
9) On met ensuite le gel d'agarose contenant l'ADN dans une solution saline
10) On appose une membrane de nitrocellulose sur le gel contenant l'ADN
11) On place du papier absorbant sur cette membrane de nitrocellulose
12) Le papier absorbe le liquide et entraine l'ADN à venir se fixer sur la membrane de nitrocellulose
13) L'ADN s'est maintenant imprimé sur cette membrane de nitrocellulose qu'on peut retirer du gel
14) On expose la membrane de nitrocellulose au UV de manière à ce que l'ADN simple brin forme des liaison covalente avec la membrane
La membrane de nitrocellulose est une véritable réplique du gel d'agarose.
15) On trempe la membrane de nitrocellulose dans le milieu d'hybridation : une solution contenant des sondes d'ADN radiactives simples brins. L'hybridation permet la reconnaissance spécifique des sondes marquées radiactivement avec leur brins d'ADN correspondant.
16) On ressort la membrane de nitrocellulose et on applique un film photographique dessus.
17) Les radiations s'impriment sur la pellicule et on peut donc de vérifier la présence du mutation!
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David
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MessageSujet: Re: Notes de cours   Ven 31 Mar à 19:54

III.4 Eléments mobiles

La majorité des gènes eucaryotes sont constitués de gènes répétés qui se déplacent dans le génome :
1) les transposons
2) les rétrotransposons

Ces deux groupes se différencient par leur mode de mobilisation.

Les transposons, appelés aussi ‘selfish genes’, utilisent un intermédiaire ADN.
Les transposons présentent des gènes de résistance aux antibiotiques

Les rétrotransposons utilisent un intermédiaire ARN pour leur mobilisation. Ils utilisent donc une transcriptase inverse pour retransformer l’ARN en ADN, comme les rétrovirus.
Les SINEs, les LINEs sont des exemple de rétrotransposons.

Ces éléments mobiles peuvent avoir un rôle mutagénique.

III.5 La détéction RFLP

La méthode RFLP permet la détection de mutation.

1) L'échantillon d'ADN est coupé par une enzyme de restriction
2) On procède ensuite à un Southern blot avec une sonde spécifique marquée radioactivement qui se fixe sur l’ADN dénaturé (donc monobrin)
3) Le Southern blot permet de connaître la taille de ces fragments et donc de les comparer d'un individu à un autre.

Grâce à des lavages contrôlés, l’appariement entre la sonde et la base n’est possible que si l’appariement est parfait.

On peut avoir soit une sonde correspondant au gène sain qui reconnaîtra uniquement la séquence saine ou on peut aussi employé la méthode RFLP avec une sonde reconnaissant une mutation.

III.6 Le clonage moléculaire

Si on désire des copies d’un gène, on utilise des cellules hôtes, qui sont des bactéries (en général E.coli).
Le clonage nécessite un vecteur de clonage capable de se répliquer dans la cellule hôte.
En général, les vecteurs sont dérivés des plasmides (<20kb inséré) ou des phages (<50kb inséré), ou des BAC (bacterial artificial chromosome <300kb)

Les plasmides sont des sortes de petits chromosomes circulaires supplémentaires présents chez les bactéries. On peut introduire la séquence désirée dans ce plasmide ou dans des phages qui vont ensuite le dupliquer de nombreuses fois.
On emploie en fait la machinerie de duplication de ces phages ou des bactéries.
Les plasmides R présentent des résistances aux antibiotiques. Cette résistance est normalement problématique pour la lutte contre les maladies. Cependant, elle est bénéfique pour le clonage moléculaire.

Principe du clonage moléculaire :

1) On extrait de l’ADN à cloner et on le coupe en fragment (avec une enzyme de restriction)
2) On extrait des plasmides (vecteur) d’une bactérie et on les ouvre
3) On met les fragments d’ADN ainsi que des gènes de selection (résistance antibiotique) avec ces plasmides ouverts et une ligase qui les recombine.
Le vecteur comprend donc le plasmide d’origine avec un fragment d’ADN et un gène de sélection insérés.
4) Un introduit ces vecteurs dans des cellules hôtes
5) On mets mets les bactéries en contact avec un antibiotique. Seules les bactéries contenant le plasmide survivent.
6) On multiplie ces bactéries en colonies avec le DNA qu’elles contiennent.
7) On sélectionne la colonie et on purifie l’ADN.

Le clonage moléculaire peut être effectué de la même manière avec des phages à la place de bactéries.

Synthèse et clonage de cDNA
Le système de l’épissage étant uniquement présent chez les eucaryotes, il faut éliminer les séquences introniques si on désire que les gènes soient exprimés dans les bactéries.
Pour cela, on emploie un RNA épissé qu’on converti en cDNA (DNA complémentaire) grâce à une transcriptase inverse (qui est caractéristique de certains virus comme le sida)
Une fois que le cDNA est synthétisé, il peut être cloné dans des plasmides.


III.7 Le PCR (amplification) et séquençage du DNA

PCR : polymerase chain reaction

Si on connaît une séquence d’ADN, on peut facilement l’amplifier par PCR.

Principe du PCR :
Le PCR est une méthode de duplication in-vitro.
On met la séquence d’ADN visée (l’ADN est donc sous forme monobrins) avec des polymérases thermostables. Le milieu est très riche en nucléotides et en amorces, ce qui permettra des duplications rapides. En suite on réalise plusieurs cycles composés de ces trois étapes :
1) On chauffe le milieu à 95 degrés pour dénaturer l’ADN.
2) On abaisse un peu la température pour permettre l’appariement des amorces
3) Synthèse d’ADN à 72 degrés grâce au polymérase thermostable

Cette méthode permet de multiplier rapidement et en très grande quantité une séquence d’ADN. Après 30 cycles, on obtient 268'435'456 molécules d’ADN double brin.

Le problème du PCR est que les erreurs sont également reproduite en très grande quantité.

III.8 Séquençage du DNA

Le séquençage = détermination de la séquence de DNA
Le DNA dont la séquence doit être déterminée doit d’abord être amplifiée par clonage ou PCR.
Puis on sépare l’ADN en 4 portions de manière à faire 4 réactions (1 pour chaque base : ACTG)

On met une portion d’ADN avec des nucléotides et un analogue ‘didéoxy’ : ddNTP.
Ces analogues sont modifiés de manière à interrompre la réplication (comme l’AZT)
Le ‘didéoxy’ est en compétition avec son nucléotide. Des fragments de plusieurs tailles seront donc produits.
En mettant ensuite les fragments de DNA fille de différentes tailles dans un gel électrophorétique, on peut connaître la longueur de chaque fragment. (les gels d’électrophorèse ont une précision permettant de différencier les fragments au nucléotide près. Le gel d’électrophorèse est composé de 4 pistes, correspondant chacune à la lecture d’un nucléotide.
En analysant ces résultats, on peut déterminer la séquence d’un fragment.

Aujourd’hui, le séquençage est automatisé. Les fragments sont marqués par fluorescence et on emploie la chromatographie pour déterminer la longueur de chacun d’entre eux. Une couleur correspond à chaque nucléotide. Les résultats sont directement traités par ordinateur.
La méthode de séquençage automatique permet un gain de temps considérable par rapport au traditionnel séquençage sur gel d’agarose.
L’ordinateur calcule lui-même les incertitudes. Les deux brins sont séquencés.
Si les incertitudes sont trop importantes, on doit séquencer à nouveau.


III.9 Applications du génie génétique

Les techniques du DNA recombinant (génie génétique) sont utiles pour la recherche biologique et médicale.
Elles ont également des applications pour l’environnement, la biotechnologie et la médecine.

Des protéines à usage thérapeutiques sont produites par les outils du génie génétique et de la biotechnologie.

Cela permet la production :
-d’insuline
-d’hormone de croissance (traite le retard de croissance)
-d’EPA (qui permet la dissolution des caillots sanguins pendant le traitement consécutif à une crise cardiaque.


Des plantes peuvent être rendu résistant à certains insectes nuisibles.
Des bactéries peuvent être rendues capable de nettoyer certains déchets toxiques

Production de protéines à usage thérapeutique :
Les bactéries ne font pas de folding ni de glycosylation des protéines. On utilise des cellules de mammifères pour obtenir des protéines correctement pliées et glycosylées
Les chaînes alpha et bêta sont synthétisées par deux bactéries différentes.
On purifie les chaînes alpha et bêta, les cystéines sont oxydées, la protéine est pliée et on arrive à la production d’une insuline active qu’on peut produire en grande quantité.

De nombreuses maladies peuvent être traitées d’une manière similaire.

Production d’animaux transgénique :
On peut produire des animaux transgéniques pour pouvoir mieux comprendre certaines maladies ou élaborer des traitements.
On distingue 3 méthodes :
1) L’injection d’un transgène dans un œuf : conduit à un animal complètement transgénique.
2) La thérapie germinale : l’injection d’une cellule transgénique dans un blastocyste qui aura pour conséquence un mosaïsme.
3) La thérapie somatique : consiste à injecter un transgène qui modifiera des cellules somatique

La thérapie génique :
On utilise un rétrovirus dans lequel on introduit un gène. Le rétrovirus est spécifique à un certain type de cellule.
La thérapie génique est encore à l’état de recherche.

Cependant, elle a été testée en France (pays civilisé ?) pour traiter un déficit immunitaire important (enfant bulle).
De la moelle osseuse a été prélevée. Ces cellules ont été infecté par un rétrovirus pour corriger le problème puis ensuite réinjectées dans la moelle.
Sur 5 enfants, 4 ont pu développer un système immunitaire normal.
Après deux ans, 2 ont développé des problèmes de leucémies. Le gène introduit par le rétrovirus s’est sans doute insérer près d’un oncogène.
(je ne fais pas de commentaire sur l'éthique.... No )
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David
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MessageSujet: Re: Notes de cours   Mer 5 Avr à 1:00

III.10 Introduction à la génomique

Les études globales de la structure des génomes et leurs séquences ont permis de montrer comment ceux-ci ont évolués.
La génomique regroupe donc en quelque sorte la génétique classique et la génétique moléculaire car on peut maintenant connaître l’organisation globale des gènes et des séquences non codantes d’une espèce donnée et les remplacer dans le génome entier.

Les séquences, couplées aux techniques d’amplification raides et d’analyse à grande échelle de polymorphisme et d’expressions des milliers de gènes en parallèle, ainsi que les progrès de la bioinformatique conduisent à une accumulation très rapide de nouvelles connaissances et à l’établissement de cartes génétiques de plus en plus précises.

Un siècle de recherche sur l’alcaptonurie (la maladie de l’urine noire)
L’acide homogentistique est excrété de manière anormalement abondante dans l’urine des malades.

1) 1889 La maladie est identifiée sous le nom de ‘black urine disease’
2) 1902 Autosomique récessive
3) 1908 Proposée en temps que déficience de l’enzyme HGO qui transforme l’ac.gentistique en ac.maleylacetoacetic.

 aucun autre progrès jusque dans les années 1990…

4) 1992 Le gène AKU est cartographié sur le chromosome 3
5) 1995 Le gène HGO est isolé depuis un champigon (Aspergillus)
6) 1996 Grâce au HGO d’Aspergillus, on trouve le cDNA humain
7) 1996 Par Northern blot, on identifie la présence de mRNA du HGO dans le foie
8) 1997 Le gène HGO est séquencé
9) 1997 Test d’hybridation de HGO sur le chromosome (in situ)
10) 1998 Le PCR des exons 10 et 12 montre des sites mutants
11) 1998 Détermination de la transmission des 2 allèles mutantes (P230S et V300G)
12) 1998 Diagnostique par RFLP

Carte de liaison génétique du chromosome humain

La carte de liaison génétique détermine :
-La position des gènes sur le chromosome
-La position de chaque sonde correspondante

Il y a de nombreuses sondes pour chaque partie du chromosomes1

Sur le chromosome 1, il y a 2000 gènes dont 600 déjà identifiés ou homologues à des gènes connus chez d’autres espèces. L’emplacement des autres est prédit par l’analyse bioinformatique, mais leurs fonctions restent encore inconnues.

Analyse de l’expression des gènes d’un génome entier
Les puces à DNA peuvent porter jusqu’à plusieurs milliers de séquences de DNA différentes et permettent d’analyser l’expression des gènes ou des polymorphisme génétiques à l’échelle du génome entier.
« Les puces à ADN consistent en un support solide (petite lame de verre comme celles utilisées en microscopie traditionnelle ou membrane de nylon) sur lequel des milliers de fragment d'ADN sont déposés de façon géométrique à l'aide d'une micropipette robotisée. Grâce à cette technique, chacun des fragments d'ADN est représenté par un point sur le support (ou puce). Ils servent de sondes pour fixer de façon très spécifique les fragments de gènes complémentaires (cibles), présents dans les échantillons biologiques à tester : leur mise en contact permet de reconstituer la double hélice d'ADN. Ce phénomène (hybridation) peut être mis en évidence par des techniques optiques sous éclairage fluorescent ou par détection de radioactivité ; un système de « marquage » de l'échantillon au moyen de traceurs fluorescents ou radioactifs ayant été réalisé préalablement. La quantification des signaux obtenus et l'identification des fragments de gènes reconnus sont ensuite rendues possibles au moyen d'un système d'acquisition d'image puis d'analyse des données faisant appel à des logiciels informatiques spécialement conçus à cet effet. Les résultats obtenus sont ensuite validés sur le plan statistique et interprétés dans un contexte biologique. »
Tiré de http://www.genopole.org/html/fr/connaitre/cite/outils/puces.htm

Donc l’analyse de l’expression des gènes d’un génome entier peut être fait grâce à cette méthode de puces à DNA.
A) On isole de l’ARN (de 2 souches différentes)
B) On génère de la cDNA à partir de ces ARN grâce à une rétro-transcriptase
C) On marque les cDNA par fluorescence (de couleur différente selon la souche)
(Par exemple rouge pour la souche A et vert pour la souche B)
D) On procède à l’hybridation dans les puces à DNA
E) Chaque point correspond à un fragment de gène connu auquel s’est hybridé soit le cDNA d’une souche, soir celui de l’autre souche, soit les deux.
On reconnaît donc quel gène est exprimé selon la souche !


On peut comparer ainsi l’expression de milliers de gènes connus en parallèle dans 2 conditions données (par exemple : au cours du développement, lors de l’inactivation expérimentale d’un gène, en réponse à un stimuli hormonal ou à un traitement médical, dans des tissus sains et pathologiques…)

Variante :
Si on utilise directement des fragments chromosomiques au lieu de cDNA, on peut analyser des polymorphismes génétiques à grande échelle
 Par exemple en biologie des population, pour des études pharmaceutiques de variabilité de réponse à des médicaments…

III.11 Pathologie moléculaire et analyse génotypique

Analyse génotypique : analyse du génome et non du produit du gène (phène)
Analyse phénotypique :  RNA, protéine, couleur, …

Les avantages de l’analyse génotypique :
1) Aucune considération de l’expression temporelle ou tissulaire
2) Aucune considération quant à l’expressivité du gène
3) Aucune influence due à l’inactivation du chromosome X
4) La fonction du gène analysé n’a pas besoin d’être connue
5) Détection de l’état de latence d’une mutation ou d’un génome étranger (un virus par ex)

Analyse génotypique peut être utilisée pour la détection de nombreuses maladies comme la dépranocytose ou l’hémophilie.

Domaine d’utilisation de l’analyse génotypique
1) Les maladies héréditaires
2) Les mutations somatiques
3) Les infections (virus, bactéries ou parasites)
4) Des identifications (greffe, médecine légale)

Considérations quantitatives :
La taille d’un gène humain est d’en moyenne 30'000bp
La taille du génome humain est de 3 x 109 bp

 Problème : détection d’un fragment spécifique dans environ 100'000 fragments différents

Approches techniques :On utilise des cellules nucléées accessibles facilement comme des cellules buccales.
On emploie 2 techniques :
1) Les enzymes de restriction et le Southern blot avec des sondes spécifiques
2) Le PCR

Détection de l’anémie falciforme (dépranocytose) :
On utilise une enzyme de restriction : la MST II qui coupe le palindrome CCTNAGG
Ce palindrome se trouve sur l’exon 1 du gène de l’hémoglobine β.
Le gène normal est indiqué : βA
Il y a trois types de mutations sur ce gène :
1) βA*: mutation silencieuse (substitution)
2) βS : mutation faux-sens (substitution)
3) βthall : mutation non-sens (délétion dans le codon 6)

L’enzyme de restriction MST 2 coupe normalement le palindrome CCTNAGG qui se trouve sur l’exon 1 du gène. Cette séquence étant modifiée dans les 3 mutations, les fragments obtenus après digestion par l’enzyme de restriction seront de taille différentes.
Etant donné qu’on sait que normalement une coupure doit se faire à un endroit précis sur l’exon 1, on pourra vérifier s’il y a coupure ou pas en vérifiant la taille des fragments par électrophorèse.

Diagnostique prénatal de l’anémie falciforme :
Si les 2 parents sont hétérozygotes, la maladie peut être transmise à la postérité. Il est possible de faire un dépistage prénatal en faisant un Southern blot avec l’enzyme de restriction MST2.
On compare les ADN du père, de la mère et du fils pour savoir si ce dernier est homozygote, porteur, ou sain.

Le diagnostic peut être soit direct soit indirect :  Direct si le gène est cloné (sonde) et si la lésion est connue et univoque. On détecte donc précisément le défaut.
 Indirect si on connaît le gène mais pas la mutation. Cela peut être le cas dans pour l’apparition de nouvelle mutation dans la population (néomutation)

Le diagnostic génotypique indirect :
Diagnostic génotypique par analyse de liaisons avec des marqueurs polymorphes.
Le principe de cette méthode consiste à distinguer le chromosome porteur du gène pathologique de son homologue normal.
On ne détecte pas directement la lésion génomique elle-même, mais des polymorphismes voisins de celle-ci servant de marqueurs.
On a donc 2 changements :
1) Un qui affecte la fonction
2) L’autre qui est une modification que l’on peut détecter par un changement dans la carte de restriction

Ceci permet un diagnostic chez les sujets dont le statut génotypique est inconnu (fœtus ou individu à risque)
On utilise cette approche par liaison seulement si la lésion génétique n’est pas directement accessible.
On procède pour à une analyse de liaison génétique à l’aide d’un marqueur RFLP.

Analyse de liaisons génétiques à l’aide d’un marqueur RFLP
Lorsqu’on ne connaît pas le gène responsable d’un phénotype ou d’une maladie propagée de manière mendélienne monogénique, on va tenter d’identifier un marqueur génotypique de type RFLP dont la propagation suit celle du phénotype.
Toutefois, on ne dispose que rarement de sites de restriction localisés à la position exacte d’une mutation provoquant un phénotype particulier !
On va donc chercher des marqueurs génétiques très polymorphiques d’un individu à l’autre, et permettant l’analyse de beaucoup de fragments de chromosomes différents à la fois.
On utilisera alors des sondes contenant des éléments répétés satellites du génome.

 on a pas la séquence de la mutation, mais un marqueur juste à côté !

Dans le cas de l’hémophilie, on distingue plus de 150 formes de mutation.
 Le diagnostic est en général semi-direct par polymorphisme de restriction.
Les mutations non-sens se caractérisent par une hémophilie grave.
Les mutations faux-sens se caractérisent par une hémophilie modérée

La plupart des maladies sur des grands gènes présentes de nombreuses mutations différentes. On utilise donc la méthode semi-directe de dépistage.

La génétique inverse
Génétique classique : identifier la protéine défectueuse puis identifier le gène
Génétique inverse : identifier le gène impliqué, puis ‘remonter’ à la protéine et en définir la fonction

Exemple : la myopathie de Duchenne
Le gène a été identifié, c’est la dystrophine.
Ce gène est très grand (2300kb) et prend 10 à 30 heures pour être répliqué !
La plupart des mutations sont dues à des délétions.
Pour un diagnostic direct, on utilise un PCR mutliplex (amplification simultanée de segments) car les produits PCR sont distinguables par leur taille.
En utilisant 2 séries de 9 couples d’amorces, on explore 17 exons et la région promotrice, ce qui permet de couvrir 90% des délétions.
60% des cas sont dus à des délétions et 30% à des microdélétions ou mutations ponctuelle)
En analysant les exons seulement, on peut observer une absence d’un d’entre eux. Cela permet de cibler rapidement l’exon responsable de la mutation.

On peut également faire des analyse pour cette maladie par Southern blot (uniquement par rapport aux sites de restriction) ou par Nothern blot (expression du gène : avec RNA)

Empreinte génétique
En plus des séquences qui correspondent à des gènes, le génome contient des séquences répétées un grand nombre de fois.
 les séquences uniques ou répétées un petit nombre de fois
 les séquences répétées : ces séquences sont transmises comme n’importe quel gène et permettent d’identifier des individus : empreinte génétique

Des vrais jumeaux ont exactement la même empreinte génétique


Recherche en paternité :
Un enfant est exclusivement constitué d’ADN provenant des parents. Les caractéristiques de son empreinte génomique sont présentes soit chez le père, soit chez la mère. La comparaison de l’empreinte génétique permet d’authentifier une filiation directe.

De cette manière on a pu déterminer 2 siècles plus tard que le président des Etats-Unis Thomas Jefferson avait eu un fils avec son esclave noire.

Les polymorphismes de nucléotides uniques SNP (single nucleotide polymorphism)
Dans la population humaine, la comparaison de la séquence du même gène chez différents individus a montré qu’il pouvait exister naturellement une différence de 1/1000 nucléotides.
Cela représente une différence d’environ 1 million de différences entre deux individus.
Cette observation permet de suivre les différentes formes d’un gène ou d’un polymorphisme dans la population.

Définir la fonction de chaque gène
On connaît actuellement la fonction de seulement 60% des gènes.
Les approches :
1) Par homologie de séquences avec des gènes dont la fonction est connue dans d’autres organismes (la narcolepsie : présente chez le chien)
2) Par réintroduction/inactivation des gènes (knock-in/knock-out)
3) Transcriptome : variation de l’expression des gènes
4) Analyse de l’effet au niveau protéique : le protéome

Décoder le génome
Le décodage du génome a un intérêt au niveau de
1) L’évolution : comparaison des génomes et fonctions des protéines / arbre de vie
2) Médecine :
 pharmacologie : réponse aux médicaments différentes selon les individus et donc selon le génome
 les maladies héréditaires, infectieuses, cancer, etc…
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David
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MessageSujet: Re: Notes de cours   Mer 5 Avr à 21:05

Détermination d’un arbre de vie
La détermination d’un arbre de vie se fait par comparaison de séquences des génomes de différents organismes.
Il permet de détecter des homologies ou des différences.
Il permet également de déterminer la filiation par des tests statistiques (parcimonie maximale)

On a pu établir que les mammifères marins et terrestres ont une origine commune.

Origine de l’homo sapiens
En comparant les séquences de l’ADN mitochondrial (maternel) et du chromosome Y (paternel) chez plusieurs individus, on a pu déterminer que l’homme actuel est descendant de l’homo erectus d’Afrique, toutes les espèces d’hominidées des autres continants ayant apparemment disparu.
Tous les hommes sont donc descendants d’ancêtres vivants en Afrique.

De la même manière on a pu comparer les séquences de plusieurs individus originaires de différents endroits de la planète. Ces études ont montrer 3 groupes avec plusieurs ramifications :
1) La Sardaigne est dans le même groupe que le Soudan et l’Ethiopie
2) L’Europe est proche des Basques, du Maroc, du Moyen-Orient et de manière un peu plus éloignée des ethnies de Sibérie, d’Asie centrale, Hunza, Pakistan et Inde
3) On trouve dans ce troisième groupe les ethnies américaine et puis les ethnies africaines d’un côté et asiatique de l’autre.

Application de la pharmacogénétique
La pharmacologie permet de mieux cibler des traitements médicamenteux.
Il existe des variations génétiques (polymorphismes) qui affectent l’âge de début, la vitesse de progression d’une maladie et la réponse thérapeutique.
La réponse aux traitements étant différente selon les individus, le traitement idéal pourrait directement être trouvé grâce à une approche pharmacogénomique et éviter ainsi de devoir réévaluer plusieurs fois le traitement pour trouver le meilleur. Ceci est d’autant plus important que les effets secondaires peuvent important selon les médicaments et causer des dommages inutiles. Cela permet donc des thérapies plus ciblées selon les individus.
La pharmacogénomique serait notamment utile dans le cas de maladies cardiovasculaires, schizophrénie (neuroleptiques), Alzheimer (anti-démence) ou Parkinson.

Exemple : la maladie d’Alzheimer et le gène de l’apolipoprotéine E
La maladie d’Alzheimer peut être due à différents problèmes et peut avoir des liens génétiques différents.
On a déjà pu identifier 3 allèles qui réagissent différemment au traitement.
 L’allèle E4 du gène de l’apolipoprotéine E (forme commune de l’Alzheimer) présente un défaut dans la synthèse de l’acéthylcholine.
La présence de cet allèle compromet la réponse thérapeutique à des traitements cholinergiques.
Le déprényl fonctionne bien chez la plupart des individus E4
 Les individus E3 et E2 répondent à un traitement au taxol.
Cependant, le taxol peut créer des lésions hépathiques.

Cet exemple nous montre l’intérêt du détermination d’un profil génétique pour l’ApoE, mais aussi la nécessité d’identifier des liens génétiques supplémentaires.

Conclusion :
1) La pharmacogénomique permet un traitement plus personnalisé
2) Elle permet l’analyse de traits complexes : maladies multigéniques
3) Elle permet de déterminer un profil génétique des personnes permettant de connaître le gène défectueux et donc le traitement approprié (locus susceptible)
4) Permet une médecine prédictive et (espérons-le) préventive
5) PROBLEME ETHIQUE : utilisation du profil génétique de l’individu !!!

Application aux maladies héréditaires, maladies infectieuses, cancer, etc…L’analyse génotypique permet d’envisager :
1) Des thérapies géniques
2) Des greffes d’organes et de tissus génétiquement modifiés
3) Des vaccins
4) Thérapies médicamenteuse ciblée, etc…

Utilisation des polymorphismes
1) Sélection de famille avec pathologie diagnostiquée (jumeaux monozygotique)
2) Analyse d’un grand nombre de régions du génome avec des marqueurs ploymorphes
3) Détermination d’une corrélation entre un forme ‘particulière’ et pathologie
4) Calcul statistique pour estimer le degré de confiance

Dermatite atopique et psoriasis

La dermatite atopique AD :
Maladie inflammatoire chronique cutanée marquée par un taux élevé des IgE (80% des cas), avec une susceptibilité accrue à l'asthme.
10-20% des enfants dans le monde occidental
On connaît 2 loci de susceptibilité
 on emploie des marqueurs microsatellites

Le psoriasis atteint lui 1-2% de la population
La dermatite atopique est distincte du psoriasis, mais dans les 2 cas on observe une inflammation avec de lymphocytes T activés.
Rarement on voit AD et psoriasis ensemble.
Il y a plusieurs loci de susceptibilité. Les 2 gènes de susceptibilité de l’AD le sont également pour le psoriasis.

AD est influencé par des gènes qui modulent les réponses du derme indépendamment des mécanismes atopiques.
Il est donc important d’identifier les gènes impliqués !

Le présent :
1) Définir l’organisation et l’alignement de toutes les séquences (uniques ou répétées) sur les chromosomes et chaque chromosomes (encore 5%)
2) Définir la fonction de chaque gène (modèles)
3) Etablir la carte des SNP (variabilité génétique dans la population humaine)

Les différents enjeux :
1) Clonage cellulaire (à ne pas confondre avec le clonage moléculaire
2) Transgenèse (OGM)
3) Cellules souches pluripotentes : embryonnaire/fœtale/adulte

Mais aussi bien sûr :
1) Sécurité des personnes
2) Sécurité de l’environnement
3) Impérativité de soigner
4) Non-discrimination sur la base du génome
5) Traitement éthique des animaux

FIN cheers
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